Immunità tumorale Farmaci antitumorali.
2INTRODUZIONE
La terapia con antitumorali mira, in generale, a bloccare l’attività metabolica e la
capacità di replicazione
delle cellule malate. In base alla modalità con cui i diversi composti riescono a esplicare
tale effetto, si possono distinguere differenti classi di farmaci antitumorali. La
chemioterapia antitumorale può essere eseguita anche in combinazione con altri
trattamenti terapeutici, quali la chirurgia e la radioterapia; ciò implica spesso una
stretta collaborazione fra medici, chirurghi ed oncologi.
Nella maggior parte dei casi di cancro, la terapia ha lo scopo di migliorare le condizioni
cliniche del paziente, cercando di allungarne la speranza di vita e di ridurre i sintomi
causati dal tumore. La scomparsa completa della malattia, però, è un obiettivo non
sempre facile da raggiungere, soprattutto negli adulti. La tendenza della ricerca
farmacologica è di individuare farmaci chemioterapici ad azione più mirata, e capaci di
migliorare la risposta immunitaria del paziente; possibili svolte nel trattamento del
cancro potrebbero anche derivare dall’applicazione della terapia genica. Basandosi su
studi immunologici si cerca ora di combattere il tumore con una precisione inaspettata
usando come un cavallo di troia l’azione delle tossine batteriche. Gli studi eseguiti a
Roma, Goteborg, ed in California dimostrano come è possibile modi”cando,
enzimaticamente, la tossina botulinica oppure con la tossina colerica introdurre
direttamente nella cellula tumorale e solo in quella l’agente antitumorale. Composti
alchilanti Un primo gruppo di chemioterapici per il trattamento dei tumori maligni
comprende una categoria di sostanze denominate alchilanti, composti sintetici
chimicamente molto diversi tra di loro. Si ritiene che agiscano formando legami II
3 covalenti fra le molecole di guanina di “lamenti vicini di DNA, impedendo cosı̀in modo
meccanico la divisione della doppia elica dell’acido nucleico, necessaria perché questo
si replichi e avvenga la mitosi. Esempi di tali farmaci sono il clorambucil, il bisulfano e
la ciclofosfamide. Nella pratica clinica vengono usati per
trattare il linfoma di Hodgkin (un tumore maligno del tessuto linfoide) e altri tipi di
linfoma, la leucemia linfocitaria cronica, il mieloma multiplo (tumore delle
plasmacellule del sangue), il seminoma (tumore del testicolo), il carcinoma ovarico, il
carcinoma mammario, il neuroblastoma (tumore del sistema nervoso, costituito da
cellule nervose embrionali) e alcuni sarcomi. Antimetaboliti Un secondo gruppo di
farmaci antitumorali è costituito dagli antimetaboliti, sostanze che, grazie alla loro
struttura chimica analoga a quella di molecole essenziali per il metabolismo cellulare,
entrano in competizione con queste e interferiscono con il metabolismo stesso. Molti di
questi farmaci, in particolare, alterano la produzione o l’incorporazione nel DNA delle
basi azotate appartenenti sia alla categoria delle purine (adenina e guanina) sia a quella
delle pirimidine (timina e citosina). Fra questi chemioterapici vi sono il metotrexate e
l’aminopterina, utilizzati per trattare la leucemia linfoblastica, il linfoma di Burkitt
(comune fra i bambini in Africa) e altri tipi di linfomi. Questi farmaci possono talvolta
risultare efficaci anche nel trattamento dei tumori della testa e del collo. Analoghi della
purina e della pirimidina Un terzo gruppo ècostituito dagli analoghi della purina e della
pirimidina, comprendenti la 6-mercaptopurina, la 2- amino-6-mercaptopurina e il 5-
fluoruracile. Queste sostanze sono formate da molecole che, sostituendosi a quelle delle
basi III azotate durante il processo di sintesi del DNA, bloccano quest’ultimo e
impediscono la proliferazione delle cellule. Si tratta di farmaci comunemente usati per
la terapia della leucemia e di alcuni linfomi. Antibiotici citotossici In”ne, un quarto
gruppo è costituito dagli antibiotici citotossici (come la mitomicina) e dagli alcaloidi
vegetali. Gli antibiotici citotossici inibiscono l’azione dell RNA (acido ribonucleico), ossia
dell’acido nucleico che interviene nel processo di sintesi delle proteine. Questi farmaci
sono molto usati, ad esempio, nella terapia del nefroblastoma (o tumore di Wilms), che
colpisce il rene e, talvolta, in alcuni tumori del testicolo. Gli alcaloidi vegetali bloccano la
mitosi; essi comprendono, ad esempio, la vinblastina e la vincristina, isolate dalla
pervinca (Vinca rosea) e usate prevalentemente per il linfoma di Hodgkin e la leucemia
linfoblastica; il taxolo, estratto dal tasso (Taxus baccata) e applicato ai tumori dell utero;
la colchicina, derivante dal colchico (Colchicum autumnale). Composti ad azione
ormonale Hanno azione antitumorale anche alcuni farmaci ad azione ormono-simile,
che cioè sono in grado di simulare l’effetto degli ormoni naturali cui alcuni tipi di cellule
tumorali sono sensibili. Ad esempio, gli ormoni femminili estrogeni favoriscono lo
sviluppo delle cellule tumorali in caso di cancro della mammella; il composto
denominato tamoxifen compete con gli estrogeni e si lega al posto di questo alle cellule,
senza stimolarne però la moltiplicazione. Risulta invece ancora controversa l e!ettiva
e#cacia antitumorale di trattamenti basati sull uso contemporaneo di farmaci ad azione
ormonale, come la cosiddetta multiterapia a base di somatostatina, IV octreotide (simile
alla somatostatina), melatonina e retinoidi (derivati della vitamina A). Altri antitumorali
Nel corso dei trattamenti è possibile ricorrere ad altri tipi di farmaci chemioterapici,
come l’idrossiurea, la procarbazina e la L-asparaginasi, che agiscono inibendo la crescita
della cellula tumorale. L’interferone, normalmente prodotto dalle cellule infettate da
virus, blocca la mitosi nelle cellule sensibili, ma i dettagli del suo meccanismo d’azione
non sono ancora noti. Altra terapia, attualmente in fase sperimentale, riguarda l impiego
di angiostatina e endostatina, due composti indicati come inibitori dell angiogenesi.
Queste proteine, infatti, hanno mostrato in modelli sperimentali la capacità di inibire la
proliferazione di nuovi vasi sanguigni all’interno della massa tumorale che, incapace di
ricevere un adeguato apporto nutrizionale, arresta la propria crescita. Rivelatesi efficaci
anche nel rallentare la comparsa di metastasi, tali composti potranno rappresentare in
un prossimo futuro un utile complemento alle più tradizionali terapie. Possibili effetti
collaterali degli antitumorali I sintomi più comunemente associati all’assunzione di
chemioterapici comprendono nausea, vomito, depressione del midollo osseo e alopecia
(perdita dei capelli). A causa della depressione del midollo osseo, i pazienti sottoposti a
chemioterapia tendono poi a sviluppare infezioni di vario tipo. L’uso di farmaci di tipo
ormonale può determinare a volte anche l insorgenza di forme depressive.
Azione sulle cellule sane I farmaci applicati al trattamento dei tumori, siano essi benigni
o maligni, in generale interferiscono con la proliferazione delle cellule, bloccandone in
vario modo l attività metabolica e la possibilità di dividersi per mitosi. Per tale motivo,
dunque, gli antitumorali presentano un grave effetto collaterale, che è quello di
interferire con l’attività non solo delle cellule malate ma anche di quelle sane: infatti, la
divisione cellulare si verifica in tutte le cellule. Le cellule sane, però, si riproducono in
modo meno veloce e incontrollato di quelle tumorali, sono meno vulnerabili ai farmaci
e quindi, dopo il trattamento chemioterapico, sembrano avere una maggiore capacitàdi
ripresa e di ricostruzione dei tessuti. Tale vantaggio selettivo di ricrescita sembra
permettere alle cellule normali di ripopolare un tessuto malato in modo preferenziale
rispetto alle cellule tumorali. Non è mai possibile, tuttavia, essere certi che tutte le
cellule tumorali siano state distrutte e, qualora ne resti qualcuna, è possibile che si
verifichi una recidiva del tumore, cioè una sua nuova comparsa; ciò non dipende
unicamente dal numero di cellule tumorali sopravvissute, ma anche dall’efficienza del
sistema immunitario del paziente nel rimuovere queste.
UNA NUOVA VIA PER INTRODURRE l’ANTITUMORALE CHEMIOTERAPICO
Una importante prospettiva per la terapia antitumorale è rappresentata dalla attuale
sperimentazione delle tossine batteriche quali chemioterapici. Come illustrato in
precedenza farmaci di sintesi ad azione chemioterapia agiscono in alcuni casi,
sostituendosi a componenti cellulari provocando la morte della cellula. Il problema di
questo tipo di farmaci è la loro azione non solo sulle cellule tumorali ma anche sulle
cellule sane e la ricerca (VI)
7 sta quindi tentando di inviare in maniera selettiva il chemioterapico solo alle cellule
tumorali ed è appunto in questo campo la immuno oncologia sta cercando di sfuttare le
tossine batteriche. Da qui l idea di costruire immuno tossine o tossine ricombinanti con
funzione di agente farmacologici. Difatti le tossine batteriche
interagendo in maniera altamente speci”ca e selettiva con macchinari molecolari chiari
delle cellule eucariotiche, si sono rivelate dei preziosi strume3nti d indagine nella
comprensione di diversi processi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, ha acquistato
una rilevanza sempre maggiore un gruppo di tossine di natura proteica capaci di
modi”care enzimaticamente le proteine G della famiglia RHO, che sono molecole
coinvolte nella regolazione di numerosi processi cellulari. Gli studi condotti da
laboratori di farmacologia e immunoterapia stanno dimostrando la capacitàdi alcune di
queste tossine batteriche di modulare alcuni di questi processi cellulari controllati dalla
RHO GPTasi, quale il differenziamento del muscolo scheletrico e soprattutto alcuni
aspetti della risposta immunitaria come specificherò più avanti. Poiché difetti in questi
ed in altri processi cellulari RHO dipendenti sono alla base di diverse patologie umane
le tossine suddette potrebbero rilevarsi estremamente utili per lo sviluppo di nuovi
agenti farmacologici in grado di curare o migliorare alcune malattie. Il risultato di questi
studi è quindi quello di realizzare tossine batteriche ricombinati comprendenti la sola
porzione enzimatica delle tossine unita a dei carrier che consentano loro di entrare nella
cellula eucaristica e di svolgere la loro azione. Volendo evidenziare la possibilità di
modulare la risposta immunitaria, sia umorale che cellulo mediata, tramite l uso di
tossine batteriche và sottolineato che, la citotossicità cellulo mediata, attuata da
particolari tipi cellulari come le cellule VII
8 natural killer (NK), svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria coinvolta
nei meccanismi di difesa contro la degenerazione neoplastica della cellula e nelle
infezioni virali. Ec noto da tempo che l attività svolta dalle cellule NK è strettamente
correlata all organizzazione del citoscheletro cellulare e che tale organizzazione è
controllata da una famiglia di proteine regolatorie, le RHOasi. Per comprendere meglio
il ruolo svolto dalle RHO GTPasi nella risposta immunitaria cellulo mediata sono stati
sviluppati studi sull attività citotossica delle cellule NK utilizzando il Fattore Citotossico
Necrotizzante 1 (CNF 1), una tossina proteica prodotta da alcuni ceppi patogeni di
escherichia coli, che agisce attivando la famiglia delle RHO GTPasi. I risultati ottenuti
mostrano che l attivazione di tali proteine G rappresenta un pre-requisito fondamentale
sia nella fase di binding che nella attività citotossica delle cellule NK. Le tossine
batteriche che modulano l attività delle proteine GTPasi potrebbero quindi giocare un
ruolo fondamentale nella modulazione del sistema immune interferendo con la funzione
o il di!erenziamento delle cellule che regolano la risposta immune locale. Prospettiva
futura èproporre la tossina oggetto di questo studio come modellino sul quale costruire
una nuova classe di agenti farmacologici che potenzino l’attivitàdelle cellule del sistema
immunitario. Nello sviluppo di queste nuove armi un grosso spunto ègiunto dallo studio
sullo sviluppo dei nuovi vaccini; i vaccini del futuro sviluppo mirato soprattutto ad
aumentare l immunogenicità o meno degli adiuvanti. Migliorare l’immunogenicità
spesso scarsa di proteine e/o peptidi è esattamente anche quello che è richiesto
dall’adiuvante, (58). Gli sviluppatori dei vaccini si sono concentrati sulla comprensione
crescente dell’importanza
CHE COSA E7UN VACCINO TIPOLOGIE DI VACCINI
CHE COSA EcUN VACCINO
E ‘una sospensione costituita da microrganismi o di frazioni isolate
dagli stessi, in grado di indurrenell’ospite una reazione
immunitaria specifica forte con memoria a lungo termine. Quello che era
preventivamente studiata come il segnale di pericolo èriconosciuto oggi come una serie
di molecole con proprietà chimiche definite (38) e proprietà genetiche distinte. Dopo
che l’attivazione dell’immunità naturale comanda ‘il segnale di pericolo’ noi troviamo
una serie di reazioni riguardanti strettamente specifici recettori, i cosiddetti patternrecognition receptors (PRRs) che legano prodotti microbici come endotossine,ad altri
prodotti membranosi di microbi o DNA. Una famiglia di tali recettori è Toll-like
receptors (TLR) che legano LPS, agelli , HSP60, CpG DNA, dsrna o peptidoglicani, tutti
con recettori unici e distinti (11; 55). Questi recettori sono localizzati sulle membrane
di molti tipi di cellule, fra di loro le cellule dendritiche (DC), i macrofagi e le cellule B che
rappresentano l’immunità naturale ed anche le più importanti cellule per la
presentazione di antigene e la stimolazione di una risposta immune (47). Nel caso di DC,
il legame con le PRRs si provocherà la migrazione e maturazione della DC in cellule
presentatrici dell antigene (APC), esprimendo una costimulazione delle molecole
richieste per la stimolazione delle cellule -T (49). Perché si abbia una visione più
dettagliata di come si attivi la immunitànaturale, attraverso lo specifico riconoscimento
di recettore, la ricerca si è concentrata in modo crescente su adiuvanti bersaglio per un
vaccino del sistema innato immunitario. L avere un bersaglio sicuro èanche un modo di
ridurre e!etti collaterali. L’ adiuvante può essere un vettore vivo, come Salmonella ed
Adenovirus che con tecniche genetiche di ricombinazione sono stati modificati per
esprimere proteine attinenti (18). I vettori adiuvanti vivi possono funzionare sia come
un sistema di consegna di antigene che da immunomodulatore e.g. attraverso il legarsi
di TLR. Comunque, i vettori vivi sono vaccini spesso instabili e solo pochi di questi basati
su questa tecnologia sono arrivati lo stato di pratica clinica. Gli adiuvanti non-viventi IX
10 possono essere formulazioni di lipide o possono gelificare (allume) creare un effetto
di deposito del vaccino dopo iniezione. Anche gli adiuvanti non viventi possono essere
sia un sistema di consegna, come liposomi e microsfere di polilactide / poliglicolide o
modulatori come il murarnile dipeptide (MDP) ed il
monofosforil lipide (MPL) (58) Visto che il campo di ricerca degli adiuvanti di vaccino è
cresciuto enormemente nella decade passata èimpossibile coprire questo campo esteso
con un colpo d’occhio, perciò, si dovranno concentrare le osservazioni sui recenti
sviluppi nel descrivere un vettore adiuvante di un vaccino attenuato che adempie il
duplice criterio: sia come bersaglio che come modulatore del sistema immunitario
naturale. Per molti anni, la tossina colerica (CT) e l ‘enterotossina dell’Escherichia Coli
ambedue instabili al calore (LT) sono stati usati in modelli animali come adiuvanti
mucosali molto potenti; comunque, queste molecole sono estremamente tossiche per
gli esseri umani (5). Recentemente sono stati sviluppati mutanti CTs e LTs con attività
enzimatica decrescente od assente e con una subunitànon modi”cata d unione (16, 27).
Queste molecole mantengono le loro proprietàdi adiuvanti e si sono dimostrate utili per
la stimolazione della risposta sistemica e per la capacità di stimolare risposte mucosali
attraverso la dispensazione per vie mucosali diverse. Comunque, i meccanismi di azione
in vivo di queste molecole cosı̀come quelli di CT e LT ancora sono sotto esame (16). In
somma, l’uso di CT, LT, e mutanti di queste tossine ha sollevato delle preoccupazioni
perché queste molecole legano al ganglioside GM1, un recettore che è onnipresente su
cellule eucariotiche (18) ed i CT hanno un e!etto tossico potenziale sui nervi olfattori. E’
stato dimostrato (23) recentemente che c è il bisogno di identificare un adiuvante
mucosale nuovo che sia efficace ed atossico e che abbia un meccanismo d azione ben
definito. X
11 L’ Escherichia coli è responsabile per una serie di malattie, tra cui : diarrea, Sindrome
uremica emolitica, infezione renali, septicemia, polmonite e meningite. Le tossine
chiamate i fattori di necrotizzazzione delle citotossine (CNFs) sono fra i fattori di
virulenza prodotti da patogeni urinari (CNF1) o enteropatogeni (CNF2)
stimolati dalla E.coli che provocano malattie nell uomo e negli animali, rispettivamente.
CNFs incita un aumento nel contenuto di “bre di stress di actina e contatti focali in cellule
coltivate. L’ E!etto del CNFs sul citoscheletro della actina è correlato da un calo nella
mobilità di electroforeticità della proteina GTP-vincolante Rho, e l’evidenza indiretta
indica che è probabile che CNF1 attivi costitutivamente Rho. La catalisi di CNF1
deammida un residuo di glutamina in posizione 63 dell Rho, trasformandolo in acido
glutamico che interdice idrolisi di GTP intrinseca e incentiva la sua proteina che GTPaseattiva che determina l’apertura del poro. Cosı̀, questa deammidazione della glutamine
63 determinata dal CNF1 èl’attivazione costitutiva di Rho, ed incita la riorganizzazione
di “bre di stress della actina. Alla nostra conoscenza, CNF1 è il primo esempio di una
tossina batterica che agisce da deamidatore di una speci”ca proteina di obiettivo. Il
segnale intracellulare coinvolto nel meccanismo di azione della tossina della zonula
occludens (ZOT) è stato molto studiato in vitro. Lo ZOT ha mostrato un e!etto selettivo
fra le varie linee di cellula esaminate, suggerendo che può interagire con un XI
12 specifico recettore la cui espressione di superficie su varie cellule differisce. Quando
èstato esaminato in monomolecole di cellule di IEC6, lo ZOT stimola una redistribuzione
del citoscheletro della F-actina. Risultati simili furono ottenuti con mucosa ileale di
coniglio, dove la riorganizzazione della F-actina dette un
aumento della permeabilità del tessuto. In cellule endoteliali, il riordinamento del
citoscheletro comportò un calo della formazione di G-actina solubile (-27%) ed un
aumento reciproco della formazione di F-actin “lamentosa (+22%). Questa
polimerizzazione di actina era tempo e dose dipendente, ed era invertibile. Pre
trattando con una speci”ca chinasi la proteina l’inibitrice del CGP41251 si abolirono
completamente gli e!etti di ZOT sulla permeabilità di tessuto e polimerizzazione della
actina. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che ZOT attiva un complesso
intracellulare e che determina una cascata di eventi che regolano la permeabilità dei
congiungimenti stretti, probabilmente mimando l’effetto di modulatore della funzione
fisiologica della barriera epiteliale. Oggi si studia la tossina zonula occludens (Zot) come
un adiuvante mucosale potenziale per introduzione intranasale (15) di antigeni. Zot è
un solo polipeptide la cui catena pesa 44.8 kda (kilodalton) codificati da un filamento
del batteriofago CTX presente nella tossina del Vibrione Colerico (1, 25),la Zot aumenta
la permeabilità del piccolo intestino colpendo la struttura dei congiungimenti stretti
tight junctions epiteliali, e questo permette il passaggio di macromolecole attraverso gli
spazi paracellulari (9, 10). Questo e!etto di Zot è stato XII
Prodotti per le Ciglia
13 chiaramente dimostrato in vivo ed in vitro su epiteli intestinali di coniglio, ratto, e
scimmia ed èdipendente al legame di Zot a specifici recettori (11, 22). Il meccanismo di
azione di Zot sui congiungimenti stretti comporta un riordinamento del citoscheletro
delle cellule epiteliali dovuta alla proteina chinasi C alfa,
dipendente dalla polimerizzazione di F-actina (10). E’importante che il fatto che Zot non
provoca danno tessutale e che il suo effetto su permeabilità intestinale è tempo dose-
dipendente e completamente invertibile (9, 10). Interessantemente una cosa analoga di
Zot è stata descritta recentemente sui mammiferi. Questa molecola, chiamata zonulina
è stata trovata su cellule epiteliali intestinali ed agisce come un moderatore endogeno
dei congiungimenti stretti (7, 26). Si èdimostrato che il pericolo segnalato, come carica
batterica o danno tissutale nell’intestino,causato dalla zonulina per essere rilasciata sul
lato luminale si lega poi al suo recettore e modula i congiungimenti stretti (8).
Interessantemente, Zot e zonulina si legano allo stesso recettore delle cellule epiteliali
ed intestinali e dividono la modalità vincolante comune al loro terminale N (3, 26). Cosı̀
sembra che Zot mimi una molecola “siologica nella regolazione dei congiungimenti
stretti, e questo meccanismo può essere responsabile del suo effetto di adiuvante
mucosale. A causa delle sue proprietà, Zot puòessere un adiuvante ideale per lo sviluppo
di vaccini mucosali. E’ stato mostrato che l introduzione intranasale di Zot come un
adiuvante stimola la produzione Ag-specifiche di immunoglobuline G (IgG) nel siero cosı̀
come le IgA in occultamenti vaginali (15) ed intestinali. Qui, noi abbiamo ricercato
l’efficacia di Zot per l’insediamento di risposte protettive e lungo-durevoli e ci siamo
chiesti se agisce attraverso la mucosale se introdotta per via intranasale e se comunque
il suo meccanismo di azione coinvolge il legame al recettore di Zot – zonulina. Adiuvanti
mucosali del vaccino attivi, che determinino una piena serie di risposte immuni e locali
e sistematiche contro XIII
14 epitopi antigenici estremamente de”niti sono il bersaglio di una attenta ricerca. La
tossina del colera (CT) ed il complesso lipofilico immuno stimolante (ISCOMs)
contengono Quil A e possono, assieme, comportarsi come adiuvanti per antigeni se
somministrati oralmente, ma attraverso vie diverse, come attestato
dalla dipendenza su IL-12 per l’effetto di ISCOMs, mentre la CT èindipendente da queste
citochine. Sfortunatamente la tossicità di della CT e le recenti scoperte di una
accumulazione di CT nel nervo olfattorio e nel bulbo dopo somministrazione intranasale
preclude l’uso clinico della CT. Comunque, c è stato un successo nel disgiungere gli
adiuvanti ed e!etti tossici di CT, costruendo un gene proteina di fusione CTA1-DD che
combina l’enzimaticamente la subunità CTA1 attiva con una cellula B individua come
bersaglio separato, D, estratto da una proteina di Sta”lococco aureus A. Sono state
combinate CTA1-DD ed ISCOMs in un vaccino adiuvato estremamente promettente ed
utilizzabile quale vettore, CTAI- DD / lscoms. Il vettore combinato è immunogenetico
quando iniettato sottocute, per via orale o nasale inducendo una forte risposta
immunitaria cellulare e umorale, incluse le IgA mucosali locali. Questi richiede la
proprietà di ribosilazione di ADP del CTA1-enzima e l’effetto del vettore combinato ha
un azione sinergica di ISCOMs o CT, usato da solo. Gli antigeni potrebbero essere
incorporato in o appena mescolato col vettore nuovo. I XIV
15 CTA1-DD e gli ISCOMS possono essere una nuova strategia per la generazione di
vaccini di mucosali potenti e sicuri. Conclusioni Come è stato sopra illustrato lo studio
dei meccanismi d azione delle tossine batteriche sia a livello della membrana cellulare
che a livello del citoplasma, sta fornendo la possibilità di utilizzare
le tossine batteriche come chiave per spegnere le cellule neoplastiche o controllarne la
crescita. Il futuro ci porterà ad avere questa ulteriore arma per combattere un male che
purtroppo è ancora spesso inattaccabile. XV
Dott Piergiulio Rossini
16 Bibliografia
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